【First-in-class药设系列】BAX变构小分子抑制剂的发现

BAX是线粒体细胞死亡通路里的关键效应蛋白，在面临多种生理刺激时和在疾病中发挥重要作用。胞浆的BAX一旦与BH3-only蛋白结合，就启动构象激活和转运，导致线粒体外膜透化作用。尽管在一系列疾病中，靶向抑制BAX带来的潜在治疗效益很明确，但是其靶向抑制剂的开发具有一定的难度。日前，美国爱因斯坦医学院研究人员在Nat Chem Biol首次报道了一类BAX的小分子抑制剂，命名为BAI，它们结合于一个新发现的口袋，并且变构抑制BAX的激活。BAI通过疏水作用和氢键结合在疏水螺旋α5，稳定疏水核心的关键区域。BAI抑制了BAX的构象激活，从而抑制了BAX的转运和寡聚化。这项研究为发现新的靶向BAX的抑制剂作了良好的范例。

细胞程序性死亡在多细胞生物体内是常规的生理过程，它可以清除不健康和多余的细胞，来确保组织的良性发展和平衡。对于急性损伤和慢性应激环境，通过细胞程序性死亡的细胞损耗会导致一系列的疾病包括心肌埂塞、中风、放化疗毒性和多种神经性疾病。遗传和生化研究表明，BCL-2家族蛋白在调控细胞凋亡发挥着关键性作用。BCL-2家族中有抗凋亡和促凋亡的成员，相对地调控着线粒体外膜透化作用和线粒体功能障碍。促凋亡的BAX或BAK被BH3-only蛋白激活对诱导线粒体外膜透化作用是必不可少的，而抗凋亡成员通过抑制促凋亡成员来抑制线粒体外膜透化作用。线粒体外膜透化作用导致细胞色素c、 Smac/Diablo和其它促凋亡因子释放到胞浆中，导致凋亡信号通路的串联激活。

BAK组成性表达于线粒体外膜，BAX主要则以单体或二聚体失活状态存在于胞质中，必须在BH3-only的激活下才能转运到线粒体外膜。一旦激活，BAX和BAK在线粒体外膜经历同寡聚化或者异寡聚化来透过外膜。最近的研究扩展了BAX的功能，BAX通过调节线粒体通透性转换孔还具有调节坏死的功能。有趣的是，对于这个功能，BAX需要转运至线粒体外膜，但不寡聚化。另外，尽管存在BAX和BAK活性冗余，在各种疾病模型中，BAX基因的单独缺失可对应激诱导的细胞死亡产生深远的保护作用。这些研究强有力的表明BAX是药理学抑制细胞死亡的有前景的靶标。

尽管利用小分子靶向BCL-2蛋白在肿瘤中重激活细胞死亡的研究有重大的突破，但是靶向这些蛋白从而抑制细胞死亡的研究是相对较少的。之前的研究显示小分子抑制BAX和BAK的运输和寡聚化有较好的效果，为BAX和BAK抑制剂展现了良好的前景。因为缺乏小分子与BAX和BAK结合的结构上的信息，阻碍了进一步的药物开发。另外，BAX不需要寡聚化就可以促进线粒体功能障碍，显示出早期抑制BAX的活化可能会更有效。

在本项工作中，研究人员利用最近研究的BAX结构和激活机制，合理抑制发现了BAX的新型抑制剂。该课题组最初想寻找BAX的直接抑制剂，却意外地发现了咔唑母核的变构化合物，可以抑制BAX和BAK线粒体相关运输。这些分子让他们识别出一个BAX上新的基于变构机制抑制BAX的结合位点。这些发现或许可以完善BAX的作用机制，为治疗BAX依赖性细胞死亡导致的疾病，提供发现BAX抑制剂的新方法。

发现BAX激活抑制剂

研究人员首先使用脂质体释放实验，进行小分子筛选。小分子评估以其抑制tBID介导的BAX活化的膜透化作用为标准。在这个实验中的抑制效应，源于BAX激活过程中多个步骤中任一步骤的抑制效应，包括构象激活、转运到脂质体表面和寡聚化。两个咔唑母核的化合物被筛选出来，只有哌嗪丙基上氟取代基和羟基的区别，分别命名为BAI1和BAI2。BAI1和BAI2被证明是浓度依赖性抑制tBID介导的BAX活化的膜透化作用，IC₅₀分别为3.3μM和4.6μM。为了确认BAI化合物的对于BAX的直接活性，比较了BAI化合物在一系列脂质体释放实验中的表现。发现BAI化合物的活性都是一致的，不受激活物质和其浓度影响。另外，对于热激活BAX，BAI化合物也有可比较的IC₅₀。 之后利用核磁（NMR）和微热量泳动（MST）的方法检测BAI1与失活态BAX的直接结合。NMR结果显示，为1：1的结合模式，MST测得解离常数BAI为15.0±4μM，BAI2为17.5±4μM。

BAI化合物结合于失活态BAX的新变构口袋

使用二维HSQC的NMR方法分析氮标记的BAX，发现BAI1与BAX亲和力为低微摩尔级别，变化最大的是α3、α4、α5和α6上的残基。使用BAI3化合物也有类似的结果。之后使用SiteMap预测出BAX上可能的结合口袋，其中有一个口袋与核磁结果一致，命名为BAI位点。再使用hy-TEMPO探针验证了口袋的存在。接下来使用分子对接，BAI1正好结合在了SiteMap预测出的口袋处，即BAI位点。另外，使用BAI2进行核磁解析和分子对接，结果与BAI1一致。最后为了验证BAI位点，研究人员首先分析核心的相互作用，做了D84K，D86K两个突变，接下来做了V83W和L120W两个突变，突变结果进一步验证了之前的结论。

BAI化合物的构效关系

继而，他们分析了BAI骨架上各官能团的对结合和抑制BAX的贡献。使用一维氢谱测量BAI化合物与BAX的结合，脂质体释放实验测量抑制效果。结果表明，失去咔唑环上的溴，降低与BAX的结合及抑制效果。BAI3上未取代的咔唑环也降低了与BAX的结合和抑制效果。BAI5上较小的氯相比BAI4的溴，导致结合变弱，但是抑制效果稍好。

BAI化合物在溶液中变构抑制BAX的激活

使用氮标HSQC研究加入BAI1后，长时间检测BIM SAHB对BAX的激活作用。在BAI1存在的情况下，在加入BIM SAHB 24h时，其诱导的BAX的激活被强力抑制，即80%的BAX仍旧单体化。长时间检测下，即使12天后，仍有50%BAX为单体。这些结果表明了，在溶液中，BAI1变构抑制了BAX的构象激活和寡聚化。

BAI化合物诱导BAX抑制的机制

为了进一步研究BAI化合物诱导BAX抑制的机制，研究人员使用了氢氘交换质谱的方法。结果显示，在BAI1结合后，对BAX结构的不同区域形成了保护作用，包括与BAI位点的α3-α4，α5和与Trigger位点有关的α1，α1-α2 loop，α3，α7，α8和α9，还有与BAX构象激活有关的区域。BAI1只在α6和α7提高了氘合并。接下来又用hy-TEMPO检测有无BAI1时PRE效应的变化。BAI1在BAX激活中引起了BAI位点（α3-α4，α5）和α3，α6，α7，α8和α9的保护作用。因为BAI1的结合，只有少数孤立的残基在hy-TEMPO结合后ΔPRE显著上升。将PRE效应映射到BAX的结构上显示，BAI1结合导致BAI位点周围区域显著的保护作用，尤其是α5的疏水核心残基，这些残基是维持BAX失活状态的核心残基。

接下来用生化的证据证明BAI化合物抑制BAX的活化，二聚化和线粒体外膜透化作用。将BAI1抑制tBID诱导BAX在脂质膜上形成的二聚体和寡聚体用BMH交联和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，发现BAI1明显抑制了BAX寡聚体的形成。另外，BAI1浓度依赖性地抑制了tBID(IC₅₀ = 5 ± 1μM )或BIM SAHB(IC₅₀ = 2 ± 1μM )诱导的BAX膜结合和转运。在Pull down实验中，BIM SAHB诱导了BAX BH3结构域的暴露，这一过程被BAI1抑制，因为BAI1抑制了BAX激活的早期构象变化。对于温度激活BAX，单独BAX组约50℃激活，加入BAI1后需有60℃才达到激活温度。

BAI1选择性抑制BAX依赖的细胞死亡

基于BAI1的抑制机制，研究人员认为BAI1应该选择性抑制BAX介导的细胞凋亡。研究人员使用小鼠成纤维上皮细胞，加入放线菌酮刺激TNFα从而引起凋亡，这一过程引起BAX/BAK的激活。BAI1有效地抑制了放线菌酮引起TNFα介导的凋亡，且呈浓度依赖性（IC₅₀=1.8μM），监控的指标为Caspase3/7的激活。为了检验对BAX的选择性，研究BAI1对野生型和BAX或BAK敲除的MEFs分别的抑制效果。在野生型和BAK敲除的细胞系中，凋亡被有效地抑制，而BAX敲除地细胞系中则无此效应。

接下来，检测BAI1在BIM BH3多肽激活BAX诱导的线粒体去极化中的作用。使用BAX和BAK双敲除的MEFs，组成型表达人源BAX，发现BAI1可以浓度依赖性的抑制BIM BH3诱导的线粒体去极化。另外，BAI1抑制了OCI-AML3细胞中BTSA1诱导BAX产生的细胞凋亡。综上，这些研究证明了BAI1对BAX的选择性和对BAX的激活和介导的细胞死亡有效的抑制效果。

BAX作为凋亡通路上的经典蛋白，其作为靶标的呼声一直很高，但由于其处于多重调控的中心，如何调控才能获得和治疗密切相关的活性小分子是BAX作为靶标进行创新药物研发的重大挑战。本文中抑制剂的发现很好的实现了精准调控BAX的目标，并清楚地阐明了BAX在凋亡中的多重作用及小分子如何去实现的机制。创新药物发现中新靶标的原创先导化合物发现往往是药物研发的源头，本工作的研究系统地给出了对新靶标药物研发“从无到有”的理解，是一个利用NMR进行First-in-class的经典案例。

参考文献：

[1] Garner T P, Amgalan D, Reyna D E, et al. Small-molecule allosteric inhibitors of BAX[J]. Nat Chem Biol. 2019 Feb 4. doi: 10.1038/s41589-018-0223-0.

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